La optimización de las condiciones de reacción para lograr un alto rendimiento de Stevia Rebaudioside D
Las dietas altas en azúcar han provocado un aumento de la prevalencia de diversas enfermedades crónicas, incluyendo obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares e hipertensión, lo que supone una importante preocupación de salud pública a nivel mundial. Stevia Rebaudioside D (Reb D), un edulcorante natural derivado de plantas, ha ganado una atención significativa como sustituto del azúcar debido a su contenido cero de calorías, dulzura intensa y agradable perfil de sabor.
Sin embargo, su presencia limitada en la stevia rebaudiana Bertoni y los desafíos relacionados con la baja solubilidad y actividad enzimática de la glicosiltransferasa de origen vegetal han obstaculizado su amplia aplicación comercial. En respuesta a estos problemas, se descubrió una nueva glicosiltransferasa llamada YojK, originaria de Bacillus subtilis 168. Este estudio introduce una glicosiltransferasa bacteriana genéticamente modificada, YojK-I241T/G327N, caracterizada por su alta solubilidad y eficiencia catalítica, ofreciendo un gran potencial para la producción a gran escala de Reb D.
El desarrollo de un método altamente eficiente para la producción de rebaudiosídeo D utilizando una reacción en cascada de enzimas YojK-I241T/G327N y AtSuSy.
To address the issue of low solubility in plant-derived glycosyltransferases, researchers investigated the potential of using YojK, an O-glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168. YojK was chosen because of its demonstrated glycosylation activity with various substrates, including large molecules. After successful recombinant expression and purification, YojK was employed to glycosylate Reb A, resulting in the production of Stevia Reb D. Enzyme kinetic analysis revealed that YojK has lower catalytic activity toward Reb D compared to other glycosyltransferases. Consequently, the study suggests the necessity for structure-guided engineering to enhance YojK's catalytic activity for potential practical applications. (as shown in Figura 1)
Figura 1
La optimización de las condiciones de reacción para lograr un alto rendimiento de rebaudiósido D.
The reaction conditions, including pH, temperature, and substrate concentration, can be optimized to achieve a high yield of Srevia Reb D. The study used molecular dynamics simulations to investigate how the YojK-I241T/G327N variant enhances Reb D glycosylation. The variant maintained a stable hydrogen bond between Reb A and H14 during simulations, unlike the wild-type(as shown in Figura 2). This stability also extended to the distance between Reb A's O2 atom and UDPG's C1P. The YojK-I241T/G327N variant's improved catalytic efficiency was attributed to these stable interactions, suggesting its practical potential.
Figura 2
Figura 3
Conclusión
Este enfoque produjo un 83,47% de Reb D. Cabe destacar que añadir 1 mM de UDPG permitió la síntesis de 20,59 g/L de Reb D con un rendimiento notable del 91,29%, superando estudios previos. Este proceso demuestra el potencial de la producción a escala industrial de Reb D, especialmente tras la ingeniería estructural de YojK.YojK puede expresarse eficientemente en E. coli BL21 (DE3) con alta solubilidad. Mediante ingeniería guiada por estructuras, se creó un mutante doble, YojK-I241T/G327N, que permitió la producción a gran escala de Reb D con un rendimiento excepcional del 91,29% mediante el reciclaje de UDPG catalizado por la sacarosa sintasa AtSuSy. Este estudio presenta YojK-I241T/G327N como una herramienta prometedora para la producción de Reb D a escala industrial económicamente eficaz.
