Ingeniería enzimática acoplada al crecimiento mediante manipulación de la regeneración de cofactores redox

Ahora se produce una gama cada vez más amplia de productos químicos a partir de materias primas renovables mediante medios biotecnológicos. Los bioprocesos dependen en gran medida de la catálisis enzimática para la producción eficiente de estos compuestos. Por tanto, garantizar que las enzimas funcionen de forma óptima en su entorno requerido es de gran interés para la producción sostenible.

Propiedades como la especificidad del sustrato, la tasa catalítica y la (termo)estabilidad están entre varios factores críticos que deben optimizarse para bioprocesos eficientes impulsados por enzimas. Esta optimización puede ser costosa, costosa y desafiante, y por tanto formas efectivas y rentables para la selección acoplada al crecimiento, las enzimas de ingeniería con características deseables son muy demandadas.

Las ventajas de usar la selección acoplada al crecimiento como una forma de selección enzimática, que implica vincular la actividad de una enzima con el crecimiento de una célula. Este método puede utilizarse como una estrategia de selección de alto rendimiento, y puede lograrse asegurando que el crecimiento dependa de la síntesis del producto por la enzima objetivo o vinculando la actividad de la enzima con el estado energético global de la célula. La biología sintética puede utilizarse para diseñar cepas adecuadas para la selección acoplada por crecimiento, y los avances recientes se han centrado en diseñar cepas deficientes en los estados oxidados o reducidos de los pares de cofactores redox, que pueden servir como plataformas de ingeniería enzimática. El uso de estas plataformas podría acelerar el desarrollo de biocatalizadores y bioprocesos mejorados.

Beneficios del acoplamiento de crecimiento mediante auxotrofia de cofactores

Los beneficios de utilizar la auxotrofia de cofactores como método de selección para la ingeniería de enzimas implicadas en la biosíntesis de ciertos químicos, como lípidos, biocombustibles, gases, disolventes orgánicos o compuestos poliméricos. Este enfoque ofrece varios beneficios únicos, incluyendo la capacidad de seleccionar el producto deseado independientemente del sustrato o producto de interés, facilitando la detección de una mejora en la actividad enzimática y ofreciendo una lectura para detectar una mayor actividad enzimática. Además, el uso de auxótrofos de cofactores como plataformas de acoplamiento de crecimiento es beneficioso porque la naturaleza ubicua de los cofactores redox en el metabolismo microbiano significa que las estrategias de ingeniería pueden transferirse lateralmente a otros microbios de interés, y las enzimas pueden ser directamente diseñadas en el entorno del hospedador microbiano deseado. (mostrado como figura 1)

Figura 1: Comparación de varias técnicas de cribado/selección ampliamente utilizadas para la ingeniería enzimática

Mutantes deficientes en oxidación de NADH

La oxidación del NADH en E. coli puede producirse por dos vías, dependiendo de la disponibilidad de oxígeno. En condiciones aeróbicas, el NADH se oxida principalmente por respiración para generar ATP, mientras que en condiciones anaeróbicas, puede oxidarse mediante vías de fermentación para producir lactato y etanol. Las cepas mutantes de E. coli, incapaces de utilizar vías mixtas de fermentación para la oxidación del NADH durante el crecimiento anaeróbico, se han utilizado para impulsar vías oxidantes de NADH para la síntesis anaeróbica de varios productos químicos, como 2-metilpropano-1-ol, 2,3-butanediol, 1-butanol y L-alanina. Estas cepas mutantes también se han utilizado para diseñar enzimas explotando principios redox similares, lo que ha dado lugar a variantes mejoradas. Las cepas resultantes pueden utilizarse para diseñar otras enzimas y vías dependientes de NAD(P)H.

Mutantes deficientes en la reducción de NAD+  

Wenk et al. crearon una cepa de E. coli eliminando el gen de la dihidrolipoil deshidrogenasa (lpd), lo que hizo que la cepa no pudiera generar potencia reductora (NADH y NADPH) a partir del metabolismo del acetato debido a la ausencia de actividad de piruvato deshidrogenasa. Esto provocó que la cepa mostrara auxotrofia para reducir la potencia cuando se cultivaba aeróbicamente sobre acetato como única fuente de carbono. (mostrado como figura 2) La cepa pudo crecer sobre acetato cuando se suplementó con sustratos glicolíticos superiores o al expresar deshidrogenasas de formiato, etanol o metanol dependientes de NAD+ con sus respectivos sustratos. La cepa no se utilizó para la ingeniería enzimática y solo se evaluó para la auxotrofia del cofactor redox.
 

Figura 2: Metabolismo central 

Mutantes deficientes en oxidación por NADPH

Existen dos estrategias diferentes para inducir la auxotrofia de NADP+ en E. coli, basándose en la ingeniería de la vía glucolítica para sobreproducir NADPH. La primera estrategia consiste en eliminar el gen nativo gapA y expresar una enzima GAPDH dependiente de NADP+ heteróloga, mientras que la segunda consiste en redirigir el flujo de carbono a través de la vía del fosfato pentosa. Las cepas resultantes no pueden crecer en glucosa, pero muestran crecimiento en diferentes condiciones, con la primera cepa crecida en condiciones anaeróbias y la segunda en condiciones aeróbias con glicerol como sustrato. Estas cepas se utilizan para ingeniería de enzimas con propiedades mejoradas, incluyendo la especificidad del sustrato, la actividad catalítica y la termoestabilidad.

Mutantes deficientes en reducción de NADP+

Tres bacterias diferentes, E. coli, P. putida y C. glutamicum, han sido diseñadas para ser NADPH-auxotróficas, lo que significa que requieren NADPH exógeno para su crecimiento. En el caso de E. coli y C. glutamicum, se eliminaron enzimas metabólicas centrales para evitar la reducción de NADP+ cuando se proporcionó glucosa como fuente de carbono, mientras que en P. putida, se utilizó ingeniería asistida por CRISPR/nCas9 para alterar secuencialmente conjuntos de genes objetivo y comprender su implicación en el metabolismo redox. Las cepas auxotróficas de NADPH se utilizaron entonces para la ingeniería enzimática acoplada al crecimiento basada en la especificidad de cofactores. Una sola ronda de mutagénesis usando E. coli produjo la deshidrogenasa formatiaque dependiente de NADP+ más eficiente y específica hasta la fecha, mientras que P. putida y C. glutamicum representan las primeras cepas de su especie que pueden emplearse para este tipo de ingeniería.

Mutantes deficientes en reducción de NMN+

Se desarrolló un sistema de selección acoplado al crecimiento para vincular el ciclo de cofactores y el crecimiento basado en una deficiencia en la reducción de NMN+. Se utilizó la cepa SHuffle de E. coli, que lleva deleciones en dos genes implicados en la producción de glutatión reducido. Se desarrolló una glutatión reductasa dependiente de NMNH mediante mutagénesis racional para vincular el proceso con el ciclo NMN+/NMNH, y se utilizó una glucosa deshidrogenasa dependiente de NMN+ para apoyar el ciclo de cofactores NMN+/NMNH y, por tanto, el crecimiento. El estudio también aplicó por primera vez la auxotrofia de cofactores redox no canónicos para la ingeniería enzimática acoplada al crecimiento, resultando en una variante termoestable de fosfita deshidrogenasa con mejor eficiencia catalítica y estabilidad temporal in vitro. El trabajo proporciona una deformación útil para la ingeniería enzimática acoplada al crecimiento, dependiente del ciclo NMN+/NMNH y auxotrófica para el estado reducido de un cofactor redox no canónico.

El potencial del acoplamiento de crecimiento mediante cofactores redox funcionó como una herramienta poderosa para diseñar biocatalizadores, especialmente en el contexto de la bioproducción sostenible. Aunque se han avanzado considerablemente en la generación de cepas auxotróficas de cofactores redox, la declaración sugiere que aún existen varias vías de investigación por explorar. Una de ellas implica la ingeniería de cepas auxotróficas cofactoras de organismos distintos a E. coli, lo que podría abrir nuevas posibilidades para la ingeniería enzimática acoplada al crecimiento.

En general, sugiere que el uso del acoplamiento de crecimiento basado en cofactores redox representa una gran oportunidad para la ingeniería de biocatálisis, especialmente para la producción de productos que no pueden satisfacer los requisitos de otros enfoques de ingeniería enzimática de alto rendimiento. Subraya la necesidad de desarrollar biocatalizadores más versátiles y eficientes para una bioproducción sostenible y subraya la importancia de continuar la investigación en esta área.


Referencia: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Ingeniería enzimática acoplada al crecimiento mediante manipulación de regeneración de cofactores redox, Biotechnology Advances, 2023.