Ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento mediante la manipulación de la regeneración del cofactor redox
Ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento mediante la manipulación de la regeneración del cofactor redox
Una gama cada vez más amplia de productos químicos se producen ahora a partir de materias primas renovables a través de medios biotecnológicos. Los bioprocesos dependen en gran medida de la catálisis enzimática para la producción eficiente de estos compuestos. Por lo tanto, garantizar que las enzimas funcionen de manera óptima en su entorno requerido es de gran interés para la producción sostenible.
Propiedades como la especificidad del sustrato, la velocidad catalítica y la (termo)estabilidad se encuentran entre varios factores críticos que deben optimizarse para bioprocesos eficientes impulsados por enzimas. Esta optimización puede llevar mucho tiempo, ser costosa y desafiante y, por lo tanto, las formas efectivas y rentables probablemente para la selección de crecimiento acoplado, las enzimas de ingeniería con características deseables son muy buscadas.
Las ventajas de utilizar la selección acoplada al crecimiento como una forma de selección de enzimas, que implica vincular la actividad de una enzima al crecimiento de una célula. Este método se puede utilizar como una estrategia de selección de alto rendimiento, y se puede lograr asegurando que el crecimiento depende de la síntesis del producto por la enzima objetivo o vinculando la actividad de la enzima al estado energético global de la célula. La biología sintética se puede utilizar para diseñar cepas adecuadas para la selección de crecimiento acoplado, y los avances recientes se han centrado en la ingeniería de cepas deficientes en los estados oxidados o reducidos de pares de cofactores redox, que pueden servir como plataformas de ingeniería de enzimas. El uso de estas plataformas puede acelerar el desarrollo de biocatalizadores y bioprocesos mejorados.
Beneficios del acoplamiento de crecimiento a través de la auxotrofia cofactor
Los beneficios de usar el cofactor auxotrofia como método de selección para la ingeniería de enzimas involucradas en la biosíntesis de ciertos productos químicos, como lípidos, biocombustibles, gases, solventes orgánicos o compuestos poliméricos. Este enfoque ofrece varios beneficios únicos, incluida la capacidad de seleccionar el producto deseado independientemente del sustrato o producto de interés, lo que facilita la detección de una actividad enzimática mejorada y ofrece una lectura para detectar una actividad enzimática mejorada. Además, el uso de auxótrofos cofactores como plataformas de acoplamiento de crecimiento es beneficioso porque la naturaleza ubicua de los cofactores redox en el metabolismo microbiano significa que las estrategias de ingeniería pueden ser transferibles lateralmente a otros microbios de interés, y las enzimas pueden diseñarse directamente dentro del entorno del huésped microbiano deseado. (se muestra como figura 1)
Figura 1: Comparación de varias técnicas de cribado/selección ampliamente utilizadas para la ingeniería enzimática
Mutantes deficientes en oxidación de NADH
La oxidación de NADH en E. coli puede ocurrir a través de dos rutas, dependiendo de la disponibilidad de oxígeno. En condiciones aeróbicas, el NADH se oxida principalmente a través de la respiración para generar ATP, mientras que en condiciones anaeróbicas, se puede oxidar a través de vías de fermentación para producir lactato y etanol. Las cepas mutantes de E. coli, incapaces de utilizar vías de fermentación mixta para la oxidación de NADH durante el crecimiento anaeróbico, se han utilizado para impulsar las vías oxidantes de NADH para la síntesis anaeróbica de diversos productos químicos, como 2-metilpropan-1-ol, 2,3-butanodiol, 1-butanol y L-alanina. Estas cepas mutantes también se han utilizado para diseñar enzimas mediante la explotación de principios redox similares, lo que resulta en variantes mejoradas. Las cepas resultantes se pueden utilizar para diseñar otras enzimas y vías dependientes de NAD(P)H.
Mutantes deficientes en la reducción de NAD+
Wenk et al. crearon una cepa de E. coli mediante la eliminación del gen de la dihidrolipoyl deshidrogenasa (lpd), lo que resultó en que la cepa no pudiera generar poder reductor (NADH y NADPH) a partir del metabolismo del acetato debido a la ausencia de actividad de la piruvato deshidrogenasa. Esto causó que la cepa mostrara auxotrofia para reducir la potencia cuando se cultiva aeróbicamente en acetato como única fuente de carbono. (se muestra como figura 2) La cepa fue capaz de crecer en acetato cuando se suplementó con sustratos glucolíticos superiores o cuando se extrajo formiato dependiente de NAD +, etanol o deshidrogenasas de metanol con sus respectivos sustratos. La cepa no se utilizó para la ingeniería enzimática y sólo se evaluó para la auxotrofia del cofactor redox.
Figura 2: Metabolismo central
Mutantes deficientes en oxidación de NADPH
Existen dos estrategias diferentes para inducir la auxotrofia NADP + en E. coli, confiando en la ingeniería de la vía glucolítica para sobreproducir NADPH. La primera estrategia consiste en eliminar el gen gapA nativo y expresar una enzima GAPDH heteróloga dependiente de NADP +, mientras que la segunda estrategia implica redirigir el flujo de carbono a través de la vía de fosfato de pentosa. Las cepas resultantes no pueden crecer con glucosa, pero muestran crecimiento en diferentes condiciones, con la primera cepa cultivada en condiciones anaeróbicas y la segunda en condiciones aeróbicas con glicerol como sustrato. Estas cepas se utilizan para diseñar enzimas con propiedades mejoradas, incluida la especificidad del sustrato, la actividad catalítica y la termoestabilidad.
Mutantes deficientes en la reducción de NADP +
Tres bacterias diferentes, E. coli, P. putida y C. glutamicum, han sido diseñadas para ser NADPH-auxotrophic, lo que significa que requieren NADPH exógeno para el crecimiento. En el caso de E. coli y C. glutamicum, las enzimas metabólicas centrales fueron eliminadas para evitar la reducción de NADP + cuando la glucosa se proporcionó como fuente de carbono, mientras que en P. putida, la ingeniería asistida por CRISPR / nCas9 se utilizó para interrumpir conjuntos de genes objetivo secuencialmente para comprender su participación en el metabolismo redox. Las cepas NADPH-auxotrofas se utilizaron para la ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento basadas en la especificidad del cofactor. Una sola ronda de mutagénesis utilizando E. coli produjo la deshidrogenasa de formiato dependiente de NADP + más eficiente y específica hasta la fecha, mientras que P. putida y C. glutamicum representan las primeras cepas de su especie que se pueden usar para este tipo de ingeniería.
Mutantes deficientes en reducción de NMN+
Se desarrolló un sistema de selección de crecimiento acoplado para vincular el ciclo del cofactor y el crecimiento basado en una deficiencia en la reducción de NMN+. Se utilizó la cepa SHuffle de E. coli, que lleva deleciones en dos genes implicados en la producción de glutatión reducido. Se desarrolló una glutatión reductasa dependiente de NMNH a través de mutagénesis racional para vincular el proceso al ciclo NMN + / NMNH, y se utilizó una glucosa deshidrogenasa dependiente de NMN + para apoyar el ciclo del cofactor NMN + / NMNH y, por lo tanto, el crecimiento. El estudio también aplicó por primera vez la auxotrofia de cofactor redox no canónica para la ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento, lo que resultó en una variante termoestable de fosfito deshidrogenasa con eficiencia catalítica mejorada y estabilidad temporal in vitro. El trabajo proporciona una cepa útil para la ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento, dependiente del ciclo NMN + / NMNH y auxotrofa para el estado reducido de un cofactor redox no canónico.
El potencial del acoplamiento del crecimiento a través de cofactores redox funcionó como una herramienta poderosa para diseñar biocatalizadores, particularmente en el contexto de la bioproducción sostenible. Aunque se ha avanzado considerablemente en la generación de cepas auxotrofas de cofactor redox, la declaración sugiere que todavía hay varias vías inexploradas para la investigación. Uno de ellos implica la ingeniería de cepas auxotrofas de cofactor de organismos distintos de E. coli, lo que podría abrir nuevas posibilidades para la ingeniería de enzimas acopladas al crecimiento.
En general, sugiere que el uso del acoplamiento de crecimiento basado en cofactores redox representa una gran oportunidad para la ingeniería de biocatálisis, particularmente para la producción de productos que no pueden satisfacer los requisitos de otros enfoques de ingeniería de enzimas de alto rendimiento. Hace hincapié en la necesidad de desarrollar biocatalizadores más versátiles y eficientes para la bioproducción sostenible y subraya la importancia de continuar la investigación en esta área.
Referencia: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.
