Cuantificación del NAD+ y sus metabolitos en los nervios ciáticos del ratón
Introducción
Las partes cruciales de la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y sus metabolitos en el envejecimiento y la neurodegeneración han sido ampliamente reconocidas. Para impulsar el progreso hacia la investigación bioquímica y las intervenciones dirigidas al envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas, es de gran importancia cuantificar con precisión el NAD+ y sus niveles de metabolitos en la vía de salvamento del NAD+. Aquí, se aplica un método LC-MS/MS robusto y preciso para cuantificar NAD+ y sus niveles de metabolitos en el nervio ciático normal y lesionado del ratón.Limitaciones de los métodos existentes para cuantificar NAD+ y sus metabolitos
Los métodos tradicionales para cuantificar NAD+ y sus metabolitos, como el HPLC-UV, NMR, la electroforesis por zona capilar o los ensayos enzimáticos colorimétricos, enfrentan diversos desafíos en sensibilidad, selectividad y medición indirecta. En cuanto a los ensayos LC-MS/MS existentes para las mediciones de NAD+ celular o tisular y sus metabolitos, aún existen muchas dificultades que superar, como tiempos de ejecución prolongados, mal comportamiento cromatográfico de retención y formas de pico insatisfactorias. Además, solo una a tres sustancias en la vía de salvamento NAD+ pueden ser cubiertas por estos métodos.Las modificaciones del método LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. Además, las condiciones de la EM están optimizadas para minimizar la señal de interferencia NAD+ en el canal cíclico de ribosa de adenosina difosfato (cADPR), manteniendo la respuesta de cADPR y mononucleótido de nicotinamida (NMN), con 4000V para el voltaje de pulverización de iones, 450°C para la temperatura del turbocalentador, 50 psi para el gas 1, 50 psi para el gas 2, 30 psi para el gas cortina y 12 psi para el gas de colisión.
Cromatógrama representativo de muestras nerviosas (normales vs lesionadas)
Los cinco analitos logran la separación basal, donde cADPR es un biomarcador sensible en el modelo de neurodegeneración. En este caso, la axotomía del nervio ciático induce degeneración axonal, lo que conduce a una reducción del nivel de NAD+ y un aumento elevado de NMN en los nervios lesionados, lo que resulta en un aumento de aproximadamente dos veces en la proporción NMN/NAD+. Simultáneamente, los niveles de nicotinamida (NAM) y ribosa de difosfato de adenosina (ADPR) se reducen aproximadamente al doble, mientras que el nivel de cADPR se incrementa más de 8 veces. Estos resultados son coherentes con los de investigaciones previamente reportadas, verificando la precisión de este método modificado LS-MS/MS para cuantificar NAD+ y sus metabolitos.
Conclusión
Este método modificado de LC-MS/MS permite una separación efectiva en la línea base de NAD+, NMN, NAM, ADPR y cADPR en un breve tiempo de ejecución de 5 minutos, lo que contribuye al diagnóstico temprano de diversos trastornos neurológicos y al desarrollo de fármacos para enfermedades del envejecimiento y neurodegenerativas.Referencia
Ma Y, Deng L, Du Z. Desarrollo y validación de un método LC-MS/MS para cuantificar el NAD+ y metabolitos relacionados en ratones y su aplicación a un modelo animal de lesión nerviosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC se ha dedicado a la I&D, fabricación y venta de materias primas para coenzimas y productos naturales desde 2012, con fábricas propias, más de 170 patentes globales y un sólido equipo de I&D. BONTAC cuenta con una amplia experiencia en investigación y desarrollo y tecnología avanzada en la biosíntesis de NAD y sus predecesores (por ejemplo, NMN y NR). Se pueden seleccionar varios tipos de NAD, que incluyen NAD Grado ER (eliminación de endoxinas), NAD Grado I (IVD/suplemento dietético/polvo crudo cosmético), NAD Grado II (API/intermedios) y NAD Grado IV (si hay requisitos superiores en solubilidad), que pueden proporcionarse en forma de polvo liofilizado o polvo cristalino. La pureza de la NAD BONTAC puede superar el 98%.
