Cuantificación de NAD+ y sus Metabolitos en Nervios Ciáticos de Ratón
Introducción
Las partes cruciales del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y sus metabolitos en el envejecimiento y la neurodegeneración han sido ampliamente reconocidas. Para impulsar el progreso hacia la investigación bioquímica y las intervenciones dirigidas al envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas, es de gran importancia cuantificar con precisión los niveles de NAD+ y sus metabolitos en la vía de rescate de NAD+. Aquí, se aplica un método robusto y preciso de LC-MS/MS para cuantificar los niveles de NAD+ y sus metabolitos en el nervio ciático de ratón normal y lesionado.Limitaciones de los métodos existentes para cuantificar NAD+ y sus metabolitos
Los métodos tradicionales para cuantificar NAD+ y sus metabolitos, como HPLC-UV, RMN, electroforesis capilar de zona o ensayos enzimáticos colorimétricos, enfrentan diversos desafíos en sensibilidad, selectividad y medición indirecta. En cuanto a los ensayos existentes de LC-MS/MS para mediciones de NAD+ y sus metabolitos celulares o tisulares, todavía hay muchas dificultades que superar, como tiempos de ejecución prolongados, comportamiento deficiente de retención cromatográfica y formas de pico insatisfactorias. Además, solo se pueden cubrir de una a tres sustancias en la vía de rescate de NAD+ con estos métodos.Las modificaciones del método LC-MS/MS
Sobre la base de los ensayos existentes de LC-MS/MS, se realizan modificaciones en cuanto a las condiciones cromatográficas, la matriz sustituta y las condiciones de MS/MS. Específicamente, se emplea 5 μM de ácido metilenfosfónico como aditivo de fase móvil, lo que promueve explícitamente la intensidad de la señal y la forma del pico. Dada la naturaleza relativamente limpia y simple de las muestras nerviosas y su pequeño tamaño, se prueba agua ultrapura como matriz sustituta. En lugar de la columna de cromatografía líquida de interacción hidrofílica y la columna Hypercarb, se utiliza la columna Waters Atlantis Premier BEH C18 AX, cuya tecnología única de superficie de alto rendimiento MaxPeak HPS (pasivando la pared interna de la columna, eliminando la superficie metálica) permite una alta reproducibilidad, simetría de pico y separación de línea base de todos los analitos.Además, se optimizan las condiciones de MS para minimizar la señal de interferencia de NAD+ en el canal de ADP-ribosa cíclico (cADPR) mientras se mantiene la respuesta de cADPR y mononucleótido de nicotinamida (NMN), con 4000 V para el voltaje de pulverización de iones, 450 ℃ para la temperatura del calentador turbo, 50 psi para Gas 1, 50 psi para Gas 2, 30 psi para gas cortina y 12 psi para gas de colisión.
Cromatograma representativo de muestras de nervio (normal vs lesionado)
Los cinco analitos logran una separación de línea base, donde cADPR es un biomarcador sensible en el modelo de neurodegeneración. Aquí, la axotomía del nervio ciático induce degeneración axonal, lo que lleva a un nivel reducido de NAD+ y un nivel elevado de NMN en los nervios lesionados, resultando en un aumento de aproximadamente 2 veces en la relación NMN/NAD+. Simultáneamente, los niveles de nicotinamida (NAM) y ADP-ribosa (ADPR) disminuyen aproximadamente 2 veces, mientras que el nivel de cADPR aumenta más de 8 veces. Estos resultados son consistentes con los de investigaciones previamente reportadas, verificando la precisión de este método modificado de LC-MS/MS para cuantificar NAD+ y sus metabolitos.
Conclusión
Este método modificado de LC-MS/MS permite una separación efectiva de línea base de NAD+, NMN, NAM, ADPR y cADPR en un tiempo de ejecución breve de 5 minutos, lo que contribuye a los diagnósticos tempranos de diversos trastornos neurológicos y al desarrollo de fármacos para el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas.Referencia
Ma Y, Deng L, Du Z. Desarrollo y validación de un método LC-MS/MS para cuantificar NAD+ y metabolitos relacionados en nervios ciáticos de ratones y su aplicación a un modelo animal de lesión nerviosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
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