La optimización de las condiciones de reacción para lograr un alto rendimiento de Stevia Rebaudiósido D
Las dietas altas en azúcar han llevado a una creciente prevalencia de diversas enfermedades crónicas, como la obesidad, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y la hipertensión, lo que representa un importante problema de salud pública mundial. Stevia Rebaudiósido D (Reb D), un edulcorante natural derivado de plantas, ha ganado una atención significativa como sustituto del azúcar debido a su contenido de cero calorías, dulzura intensa y perfil de sabor agradable.
Sin embargo, su limitada presencia en stevia rebaudiana Bertoni y los desafíos relacionados con la baja solubilidad y la actividad enzimática de la glicosiltransferasa derivada de plantas han obstaculizado su aplicación comercial generalizada. En respuesta a estos problemas, se descubrió una nueva glicosiltransferasa llamada YojK, originaria de Bacillus subtilis 168. Este estudio introduce una glicosiltransferasa bacteriana modificada genéticamente, YojK-I241T/G327N, caracterizada por una alta solubilidad y eficiencia catalítica, que ofrece un gran potencial para la producción a escala industrial de Reb D.
El desarrollo de un método altamente eficiente para la producción de rebaudiósido D utilizando una reacción en cascada de enzimas YojK-I241T/G327N y AtSuSy.
Para abordar el problema de la baja solubilidad en glicosiltransferasas derivadas de plantas, los investigadores investigaron el potencial del uso de YojK, una O-glicosiltransferasa de Bacillus subtilis 168. YojK fue elegido debido a su actividad demostrada de glicosilación con varios sustratos, incluyendo moléculas grandes. Después de una expresión y purificación recombinante exitosa, YojK se empleó para glicosilar Reb A, lo que resultó en la producción de Stevia Reb D. El análisis cinético enzimático reveló que YojK tiene una menor actividad catalítica hacia Reb D en comparación con otras glicosiltransferasas. En consecuencia, el estudio sugiere la necesidad de ingeniería guiada por estructura para mejorar la actividad catalítica de YojK para posibles aplicaciones prácticas. (como se muestra en la Figura 1)
Figura 1
La optimización de las condiciones de reacción para lograr un alto rendimiento de rebaudiósido D.
Las condiciones de reacción, incluidos el pH, la temperatura y la concentración del sustrato, se pueden optimizar para lograr un alto rendimiento de Srevia Reb D. El estudio utilizó simulaciones de dinámica molecular para investigar cómo la variante YojK-I241T / G327N mejora la glicosilación de Reb D. La variante mantuvo un enlace de hidrógeno estable entre Reb A y H14 durante las simulaciones, a diferencia del tipo salvaje (como se muestra en la Figura 2). Esta estabilidad también se extendió a la distancia entre el átomo de O2 de Reb A y el C1P de UDPG. La eficiencia catalítica mejorada de la variante YojK-I241T/G327N se atribuyó a estas interacciones estables, lo que sugiere su potencial práctico.
Figura 2
Figura 3
Conclusión
Este enfoque produjo 83.47% Reb D. Notablemente, la adición de 1 mM UDPG permitió la síntesis de 20.59 g / L Reb D con un notable rendimiento del 91.29%, superando estudios anteriores. Este proceso demuestra el potencial para la producción de Reb D a escala industrial, especialmente después de la ingeniería estructural de YojK.YojK se puede expresar eficientemente en E. coli BL21 (DE3) con alta solubilidad. A través de la ingeniería guiada por estructura, se creó un mutante doble, YojK-I241T / G327N, que permite la producción a gran escala de Reb D con un rendimiento excepcional del 91,29% mediante el reciclaje de UDPG catalizado por la sacarosa sintasa AtSuSy. Este estudio presenta YojK-I241T/G327N como una herramienta prometedora para la producción de Reb D a escala industrial económicamente efectiva.
