Cuantificación de NAD+ y sus metabolitos en nervios ciáticos de ratón
Introducción
Las partes cruciales del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y sus metabolitos en el envejecimiento y la neurodegeneración han sido ampliamente reconocidos. Para estimular el progreso hacia la investigación bioquímica y las intervenciones dirigidas al envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas, es de gran importancia cuantificar con precisión los niveles de NAD+ y sus metabolitos en la vía de rescate de NAD+. Aquí, se aplica un método LC-MS/MS robusto y preciso para cuantificar los niveles de NAD+ y sus metabolitos en el nervio ciático de ratón normal y lesionado.Limitaciones de los métodos existentes para cuantificar el NAD+ y sus metabolitos
Los métodos tradicionales para cuantificar el NAD+ y sus metabolitos, como la HPLC-UV, LA RMN, la electroforesis de la zona capilar o los ensayos enzimáticos colorimétricos, se enfrentan a diversos retos en cuanto a sensibilidad, selectividad y medición indirecta. En cuanto a los ensayos LC-MS/MS existentes para mediciones de NAD+ celular o tisular y sus metabolitos, todavía hay muchas dificultades que superar, como tiempos de ejecución prolongados, comportamiento de retención cromatográfica deficiente y formas de pico insatisfactorias. Además, solo de una a tres sustancias en la vía de rescate de NAD+ pueden ser cubiertas por estos métodos.Las modificaciones del método LC-MS/MS
Sobre la base de los ensayos LC-MS/MS existentes, se llevan a cabo las modificaciones relativas a las condiciones cromatográficas, la matriz sustituta y las condiciones MS/MS. En concreto, se emplean 5 μM de ácido metileno fosfónico como aditivo de fase móvil, lo que promueve explícitamente la intensidad de la señal y la forma del pico. Dada la naturaleza relativamente limpia y simple de las muestras de Never y su pequeño tamaño, el agua ultrapura se prueba como una matriz sustitutiva. En lugar de la columna de cromatografía líquida de interacción hidrofílica y la columna de hipercarbohidratos, se utiliza la columna Atlantis Premier BEH C18 AX de Waters, cuya exclusiva tecnología de superficie de alto rendimiento MaxPeak HPS (pasivación de la pared interna de la columna, eliminación de la superficie metálica) permite la alta reproducibilidad, simetría de picos y separación de referencia de todos los analitos.Además, las condiciones de MS están optimizadas para minimizar la señal de interferencia NAD+ en el canal de adenosina difosfato ribosa cíclico (cADPR) mientras se mantiene la respuesta de cADPR y mononucleótido de nicotinamida (NMN), con 4000 V para el voltaje de pulverización de iones, 450 °C para la temperatura del turbocalentador, 50 psi para el gas 1, 50 psi para el gas 2, 30 psi para el gas de cortina y 12 psi para el gas de colisión.
Cromatograma representativo de muestras nerviosas (normales vs lesionadas)
Los cinco analitos logran la separación basal, donde el cADPR es un biomarcador sensible en el modelo de neurodegeneración. En este caso, la axotomía del nervio ciático induce la degeneración axonal, lo que conduce a una reducción del nivel de NAD+ y a un nivel elevado de NMN en los nervios lesionados, lo que resulta en un aumento de aproximadamente 2 veces en la relación NMN/NAD+. Al mismo tiempo, los niveles de nicotinamida (NAM) y adenosina difosfato ribosa (ADPR) disminuyen aproximadamente 2 veces, mientras que el nivel de cADPR aumenta más de 8 veces. Estos resultados son consistentes con los de investigaciones reportadas anteriormente, verificando la precisión de este método LS-MS/MS modificado en la cuantificación de NAD+ y sus metabolitos.
Conclusión
Este método LC-MS/MS modificado permite una separación basal eficaz de NAD+, NMN, NAM, ADPR y cADPR en un breve tiempo de ejecución de 5 minutos, lo que contribuye al diagnóstico temprano de diversos trastornos neurológicos y al desarrollo de fármacos para el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas.Referencia
Ma Y, Deng L, Du Z. Desarrollo y validación de un método LC-MS/MS para cuantificar NAD+ y metabolitos relacionados en nervios ciáticos de ratones y su aplicación a un modelo animal de lesión nerviosa. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACse ha dedicado a la investigación y desarrollo, fabricación y venta de materias primas para coenzimas y productos naturales desde 2012, con fábricas propias, más de 170 patentes globales, así como un sólido equipo de investigación y desarrollo. BONTAC tiene una rica experiencia en investigación y desarrollo y tecnología avanzada en la biosíntesis deNAD y sus precursores(p. ej. NMN y NR). Hay varios tipos de NAD que se pueden seleccionar, que abarcan el grado NAD ER (eliminación de endoxina), el NAD Grado I (IVD / suplemento dietético / polvo crudo cosmético), el NAD Grado II (API / intermedios) y el NAD Grado IV (si hay algún requisito mayor en la solubilidad), que se puede proporcionar en forma de polvo liofilizado o polvo cristalino. La pureza de BONTAC NAD puede alcanzar más del 98%.
