Cuantificación NAD+ y sus metabolitos en nervios ciáticos de ratón

Introducción

Las partes cruciales del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) y sus metabolitos en el envejecimiento y la neurodegeneración han sido ampliamente reconocidas. Para estimular el progreso hacia la investigación bioquímica y las intervenciones dirigidas al envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas, es de gran importancia cuantificar con precisión el NAD+ y sus niveles de metabolitos en la vía de rescate del NAD+. Aquí, se aplica un método LC-MS/MS robusto y preciso para cuantificar los niveles de NAD+ y sus metabolitos en el nervio ciático de ratón normal y lesionado.

Limitaciones de los métodos existentes para cuantificar NAD+ y sus metabolitos

Los métodos tradicionales para cuantificar NAD+ y sus metabolitos, como HPLC-UV, NMR, electroforesis de zona capilar o ensayos enzimáticos colorimétricos, enfrentan varios desafíos en sensibilidad, selectividad y medición indirecta. En cuanto a los ensayos LC-MS/MS existentes para las mediciones de NAD+ celular o tisular y sus metabolitos, todavía hay muchas dificultades que superar, como tiempos de ejecución prolongados, comportamiento de retención cromatográfica deficiente y formas de pico insatisfactorias. Además, solo de una a tres sustancias en la vía de rescate de NAD+ pueden cubrirse con estos métodos.

Las modificaciones del método LC-MS/MS

Sobre la base de los ensayos LC-MS/MS existentes, se realizan las modificaciones relativas a las condiciones cromatográficas, la matriz sustituta y las condiciones MS/MS. Específicamente, se emplean 5 μM de ácido metileno fosfónico como aditivo de fase móvil, que promueve explícitamente la intensidad de la señal y la forma del pico. Dada la naturaleza relativamente limpia y simple de las muestras nunca y su pequeño tamaño, el agua ultrapura se prueba como matriz sustituta. En lugar de la columna de cromatografía líquida de interacción hidrofílica y la columna de hipercarb, se utiliza la columna Atlantis Atlantis Premier BEH C18 AX de Waters, cuya exclusiva tecnología de superficie de alto rendimiento MaxPeak HPS (pasivación de la pared interna de la columna, eliminación de la superficie metálica) permite la alta reproducibilidad, la simetría de picos y la separación de referencia de todos los analitos.Además, las condiciones de MS están optimizadas para minimizar la señal de interferencia NAD+ en el canal cíclico de adenosina difosfato ribosa (cADPR) mientras se mantiene la respuesta de cADPR y mononucleótido de nicotinamida (NMN), con 4000 V para voltaje de pulverización de iones, 450 ° C para temperatura del turbocalentador, 50 psi para Gas 1, 50 psi para Gas 2, 30 psi para gas de cortina y 12 psi para gas de colisión.

Cromatograma representativo de muestras nerviosas (normales vs lesionados)

Los cinco analitos logran la separación basal, donde cADPR es un biomarcador sensible en el modelo de neurodegeneración. En este caso, la axotomía del nervio ciático induce la degeneración axonal, lo que lleva a una reducción del nivel de NAD+ y un nivel elevado de NMN en los nervios lesionados, lo que resulta en un aumento de aproximadamente 2 veces en la relación NMN/NAD+. Simultáneamente, los niveles de nicotinamida (NAM) y adenosina difosfato ribosa (ADPR) disminuyen aproximadamente 2 veces, mientras que el nivel de cADPR aumenta en más de 8 veces. Estos resultados son consistentes con los de investigaciones reportadas anteriormente, verificando la precisión de este método LS-MS/MS modificado para cuantificar NAD+ y sus metabolitos.

Conclusión

Este método modificado de LC-MS/MS permite una separación basal efectiva de NAD+, NMN, NAM, ADPR y cADPR en un breve tiempo de ejecución de 5 minutos, lo que contribuye al diagnóstico temprano de diversos trastornos neurológicos y al desarrollo de fármacos para el envejecimiento y las enfermedades neurodegenerativas.

Referencia

Ma Y, Deng L, Du Z. Desarrollo y validación de un método LC-MS / MS para cuantificar NAD + y metabolitos relacionados en ratones nervios ciáticos y su aplicación a un modelo animal de lesión nerviosa. J Chromatogr A. doi: 10.1016 / j.chroma.2024.464821

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